ICS07.080 CCSC27 中华人民共和国国家标准 GB/T47201—2026 小牛肠碱性磷酸酶活性及纯度检测方法 Assaymethodofcalfintestinalalkalinephosphataseactivityandpurity 2026-02-27发布 2026-06-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅳ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 原理 1 ……………………………………………………………………………………………………… 5 试剂或材料 1 ……………………………………………………………………………………………… 6 试验步骤 2 ………………………………………………………………………………………………… 7 质量控制 3 ………………………………………………………………………………………………… ⅠGB/T47201—2026 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。 本文件起草单位:南生(厦门)分析检测有限公司、申亚生物科技股份有限公司、夏禾(深圳)生物技 术有限公司、北京索莱宝科技有限公司、夏禾(广州)光电生物科技有限公司、武汉新华扬生物股份有限 公司、杭州博岳生物技术有限公司、广州万孚生物技术股份有限公司、江苏创健医疗科技股份有限公司、 北京利德曼生化股份有限公司、福建赛福安全技术服务有限公司、夏禾(杭州)生物技术有限公司、华灿 (厦门)生物医药有限公司、福建南生科技有限公司、大田华灿生物科技有限公司、海南华研胶原科技股 份有限公司、山东大学、苏州大学、上海交通大学、复旦大学、福建农林大学、浙江工商大学、浙江师范大 学、厦门大学、上海楚豫生物科技有限公司。 本文件主要起草人:黄发灿、刘洪艳、黄恩铭、马玉岭、郑登忠、徐丽、李因来、孙雅玲、凡孝菊、李冉、 陈雅平、郭延巍、潘威、王芳、胡月、赵子方、傅玲琳、陈秀兰、冯雁、赵超、王翠、沈涛、杨忠华、刘斌、 邢志刚、钟江、朱力、姚鹃、张永有、郑恬烨、黄思涛、潘排凤、黄海燕、郑丽明、黄连华。 ⅢGB/T47201—2026 引 言 小牛肠碱性磷酸酶是一种能在碱性环境下高效催化5’和3’磷酸单酯去磷酸化反应并水解释放5’ 末端或3’末端磷酸基团的水解酶,用于抗体或抗原的标记。制定小牛肠碱性磷酸酶活性及纯度检测方 法的国家标准,用以促进生产和使用,对推动该类工具酶的产业化具有重要意义。 ⅣGB/T47201—2026 小牛肠碱性磷酸酶活性及纯度检测方法 1 范围 本文件描述了小牛肠碱性磷酸酶活性及纯度的检测方法。 本文件适用于小牛肠碱性磷酸酶活性及纯度的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T40174—2021 工具酶纯度的检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 小牛肠碱性磷酸酶 calfintestinalalkalinephosphatase 能在碱性环境下高效地催化5’和3’磷酸单酯去磷酸化反应的水解酶。 3.2 小牛肠碱性磷酸酶活性单位 activityunitofcalfintestinalalkalinephosphatase 在pH9.8的二乙醇胺(DEA)缓冲液中,37℃条件下,每分钟小牛肠碱性磷酸酶水解对硝基苯磷酸 酯(PNPP)显色底物产生1μmol对硝基苯酚(PNP)所需的酶量为一个活性单位。 4 原理 以对硝基苯磷酸酯(PNPP)为底物、二乙醇胺为磷酸酰基的受体,在碱性条件下,小牛肠碱性磷酸 酶催化PNPP水解产生游离的黄色对硝基苯酚(PNP),该黄色物质在波长405nm处有特异吸收峰,通 过测定405nm处吸光度的增加速率计算出该酶的活性单位。 5 试剂或材料 5.1 水 符合GB/T6682规定的二级水。 5.2 1mol/L氯化镁溶液 称取20.33g的六水合氯化镁(分析纯),用水溶解,并定容至100mL。 1GB/T47201—2026 5.3 1mol/L二乙醇胺溶液 称取52.57g二乙醇胺(分析纯),加入适量水溶解,用6mol/L盐酸调pH值至37℃时10.1~ 10.3,加入0.25mL的1mol/L氯化镁溶液(5.2),用2mol/L盐酸调pH值至37℃时9.8,混匀并定容 至500mL。新鲜配制,避光。 5.4 0.67mol/LPNPP溶液 称取247mgPNPP,用水溶解并定容至1mL。临用现配,避光。 5.5 供试品酶稀释液 称取1.20g牛血清白蛋白和0.90g氯化钠,用水溶解,并定容至100mL。 5.6 供试品酶溶液 取小牛肠碱性磷酸酶适量,用冰预冷的供试品酶稀释液溶解,并稀释成约0.15U/mL小牛肠碱性 磷酸酶的溶液。 6 试验步骤 6.1 酶活性检测 6.1.1 底物工作溶液 按表1配制底物工作溶液,37℃水浴恒温。 表1 底物工作溶液配制表 试剂试验组 mL对照组 mL 1mol/L二乙醇胺溶液(5.3) 2.90 2.90 0.67mol/LPNPP溶液(5.4) 0.05 0.05 6.1.2 酶促反应 用紫外-可见分光光度计监测底物工作溶液在405nm波长下的吸光度值(A405)恒定后,按表2加 样,并在405nm波长下测吸光度值,每分钟读数1次,共5min,取相邻两数读数差值ΔA405的平均值。 表2 酶促反应加样表 试剂试验组 mL对照组 mL 供试品酶溶液 0.05 — 水 — 0.05 6.1.3 结果计算 6.1.3.1 单位体积小牛肠碱性磷酸酶活性单位按公式(1)计算: 2GB/T47201—2026